طراحی و تهیه ی ساختار ژنتیکی یک فلوبادی حاوی پروتئین سبز فلورسنت و قطعه ی تک زنجیره ای ناحیه ی متغیر آنتی بادی ضد گیرنده ی cd4 انسانی

پروتئین سبز فلورسنت green fluorescent protein (gfp)، پروتئینی با وزن مولکولی kda 27 شامل 238 اسیدآمینه و دارای ساختار فضایی بشکه ی ? می باشد که برای اولین بار در سال 1962 از ستاره ی دریاییaequorea victoria جداسازی شد. این پروتئین به دنبال تحریک با نور آبی، فلورسنس سبز ساطع کرده و این ویژگی باعث شده تا gfp به عنوان نشانگر برای بیان پروتئین های نوترکیب، گزارشگر برای بیان ژن و به عنوان برچسب برای مشخص کردن جایگاه پروتئین ها در سلول های زنده استفاده شود.gfp به طور ژنتیکی با پروتئین های بسیاری در گونه های مختلف برای تولید مولکول های پایدار که هم فعالیت بیولوژیک اولیه ی خود و هم ویژگی های فلورسنت gfp را حفظ می کنند، ادغام شده است. egfp نوع جهش یافته ای از gfp است که دارای فلورسنسی 35 برابر شدیدتر نسبت به نوع وحشی می باشد. یکی از معمول ترین فرم های آنتی بادی نوترکیب، قطعه ی تک زنجیره ای ناحیه ی متغیر (scfv) می باشد. یک آنتی بادی در فرمت scfv شامل نواحی متغیر زنجیره های سبک و سنگین (vh) و (vl) می باشد که به وسیله ی یک توالی اتصال دهنده به یکدیگر متصل می شوند.scfv می تواند به آسانی در escherichia coli بیان شود. از مزایای scfv نسبت به آنتی بادی کامل نفوذ بهتر به بافت ها به دلیل اندازه ی کوچک تر و امکان پاک سازی سریع تر کمپلکس های ایمنی تشکیل شده می باشد. در مقایسه با آنتی بادی طبیعی scfv به گلیکوزیلاسیون نیاز ندارد و می تواند به طور فعال در باکتری که فاقد سیستم تغییرات پس ترجمه است، تولید شود. cd4گلیکوپروتئین غشایی با وزن مولکولی تقریبیkda 55 است که در سطح زیر گروه های خاصی از لنفوسیت هایt بروز می یابد. cd4 یک کمک گیرنده بوده که با گیرنده های سلول t همکاری می کند. علاوه بر این، cd4 گیرنده ای برای ویروس نقص ایمنی انسان (hiv) نیز می باشد. در پژوهش حاضر یک ساختار ژنتیکی برای تولید کارامد یک آنتی بادی فلورسنت به صورت یک پروتئین نوترکیب در e.coli با ادغام egfp به scfv آنتی بادی ضد cd4 طراحی و ساخته شد. ژن egfp پس از تکثیر به وسیله ی pcr و برش با آنزیم های محدود کننده ی خاص، در انتهای n مولکول scfv کلون شد. صحت کلونینگ با کلنی-pcr و هضم آنزیمی تأیید شد. سپس تعیین توالی به منظور اطمینان از عدم وقوع جهش در ساختار و نیز صحیح بودن قالب خواندن egfp-scfv انجام گرفت. در نهایت بیان فلوبادی بعد از ترانسفورم کردن e.coli hb2151 و القای پلاسمید با iptg به وسیله ی تکنیک dot blotting وwestern blotting با استفاده از آنتی بادی ضدegfp انجام شد.